PCR-PHFA法によるK-rasコドン12変異検出キット

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K-ras遺伝子は12番目のコドンにアミノ酸置換を伴う変異が生じた場合に発癌遺伝子として働く事が知られています。特に膵臓ガンとの相関が高 く、約80-90%でK-ras遺伝子の変異が検出されています。このたび、このK-rasコドン12の変異をPCRで検出するキットを新発売致しまし た。

キット内容

1.	増幅試薬A	550μl
2.	増幅試薬B	140μl
3.	野生型DNA	350μl
4.	標識(固相)DNAチューブ	12本
5.	8連チューブ用キャップ	12本
6.	試料用希釈液	2.5 ml
7.	酵素標識抗体溶液	120μl
8.	抗体用希釈液	12 ml
9.	判定ウェル	12本/枚
10.	洗浄液、x10	50 ml
11.	発色基質液	120μl
12.	発色基質用緩衝液	12 ml
13.	発色停止液	12 ml

測定原理

PCR-PHFA(PCR-Preferential Homoduplex Formation Assay)法はPCR産物中の1塩基の置換を検出する方法として開発されました。この方法は穏やかな温度勾配によるアニーリングにより完全に相補的な2 本鎖が非常に特異的に形成されるという性質と、両末端が標識されたPCR産物を特異的に検出する方法(ED-PCR: Enzymatic Detection of PCR product)を応用したものです。

本キットには、標識DNAとして6種類の変異遺伝子(AGT, CGT, TGT, GAT, GCT, GTT)と野生型遺伝子(GGT)がチューブに標識(固相)されています。この各標識DNAを検体の増副産物と反応させ、末端のDNPに対するAP標識抗 DNP抗体と基質の反応後の吸光度を測定する事によって、検体中のK-ras遺伝子がどの変異遺伝子を持つかを半定量的に検出する事が出来ます。

操作手順

1. 検体DNA溶液の調製－市販のDNA抽出キットを用いてDNAを抽出します。検体は血液、組織、膵液です。
2. PCR反応－増幅試薬AとB,および検体を入れ、通常のPCRを行います。
3. 熱変性と温度勾配によるアニーリング－PCR反応液を標識(固相)DNAチューブに加え、89℃から80℃までを60分間徐々に冷却します。冷却温度は0.15℃／分です。
4. 検出－判定ウェルに酵素標識抗体を加えます。温度勾配によるアニーリングを行った溶液を加えます。吸引、洗浄後、基質液を加えます。反応停止液を加えた後、405 nmの吸光度を測定します。

測定結果の判定法

野生型DNA増副産物で得られた各変異型(AGT, CGT, TGT, GAT, GCT, GTT)の標識(固相)DNAに対して、検体の増副産物で得られた各変異型の標識DNAの発色の比率をIndex値として以下のように計算します。

野生型DNA増副産物を加えた標識DNAの吸光度

Index値は検体が野生型遺伝子のみを有する場合には、各変異型の標識DNAに対して100となります。検体が変異遺伝子を含む場合には、検体中に含まれる変異遺伝子含量が高いものほどIndex値は低くなります。

各標識DNAのIndex値から変異遺伝子含量を以下の表に従って判定します。

Index値	80以上	80-67	67-33	33-9	9-2	2以下
変異遺伝子含量(%)	0.25以下	0.25-0.5	0.5-2	2-10	10-50	50以上
判定	－	＋／－	1＋	2＋	3＋	3＋

製品名	製品番号	包装単位
K-rasコドン12変異検出キット	489977	12テスト