セル プロリフェレーション試薬WST-1を用いてのレポータージーンアッセイの標準化

2 TIPS and FACTS

Key words:

レポータージーンアッセイの標準化、細胞数の測定、細胞障害性効果の測定

トランスフェクト真核細胞での遺伝子発現は、通常プロモーター配列と、容易に検出できる”レポーター”遺伝子を連結する事で、研究されます。
細胞培養の変動を除外するため個々のウェルの結果は、タンパク質濃度や細胞数について標準化しなければなりません。また細胞量のモニタリングも、しばしば 細胞毒性の影響の指標として用いられます。現在多くの実験室では、標準化をタンパク質定量で行っています。この方法は時間がかかり、面倒で、しかも操作ス テップ(標準曲線、サンプル調製、希釈、データの作成など)が多いため不正確です。

WST-1で簡単に

WST-1は細胞数や細胞毒性効果、タンパク質濃度の簡単な測定を保証し、しかもレポータージーンアッセイの性能には影響を与えません。
セル プロリフェレーション試薬WST-1はready-to-useで、細胞の代謝活性を定量的にモニターします。WST-1の可溶性フォルマザン塩への転換 は、直接的に細胞数と相関します。この方法は細胞の洗浄やハーベストを必要とせず、細胞培養プレート内ですべてが行えます。またELISAリーダーをオン ラインコンピュータとリンクさせる事により、ハイスループットスクリーニングに、特に有利な自動データ作成が可能となります。

WST-1試薬の優位性

• 高感度で正確
• 簡便
• 低コスト
• 短時間
• オールインワン

WST-1アッセイ法

1. 細胞培養を行い、各自の標準法でトランスフェクトする。
2. 細胞溶解の30-120分前、培地に10%のWST-1を加える。
3. WST-1の変換を直接、あるいは分注分をELISAリーダーで定量化する。
4. 試薬/培地を捨て、レポーターアッセイのために細胞を溶解する。
5. WST-1アッセイの吸光度に従い、レポーターアッセイの結果を標準化する。

ここにレポータージーンアッセイと組み合せた、タンパク質の定量とWST-1による標準化の比較が示されています。これらのデータは、次のことを示しています。

1. WST-1の吸光度はプロテインアッセイの結果と同値である。
2. WST-1の変換はタンパク質の定量と同じ感度である。
3. WST-1の吸光度は細胞数の結果と同値である。
4. WST-1アッセイはレポータージーンアッセイの結果に干渉しない。

実験1:
WST-1の吸光度はプロテインアッセイの結果と同値です。
一連の実験において、CHO-K1細胞が血清存在下(A)及び血清不在下(B)で異なるプラスミド、DNA量、トランスフェクション試薬によりトランス フェクトされました。WST-1試薬は細胞溶解に1時間アプライされました。インキュベーション後、100μlの培地をMTPに移し、吸光度を 450/690 nmで測定しました。その後、延伸した細胞溶解物の20μlを取り、BCA法(MTPマイクロアッセイ)によりタンパク質の定量を行いました。

実験2:
WST-1の変換は、少なくともタンパク質の定量と同じ感度です。
異なる数のCOS-7細胞を24ウェルプレートに播種し、オーバーナイトで培養しました。WST-1を培地に1時間アプライし、吸光度を450/690 nmで測定しました。培地を捨てた後、PBSで洗浄し細胞を溶解しました。タンパク質の定量はBCA法で行いました。

実験3:
WST-1の値はルシフェラーゼ活性と相関し、すべての細胞がルシフェラーゼを発現しているため、細胞数とも相関しています。
WST-1アッセイはルシフェラーゼ レポータージーン アッセイの結果に干渉しません。ホタル ルシフェラーゼを構築された安定なHep2G細胞が96ウェルプレートに、様々な数で播種されました。24時間後、細胞はWST-1で1時間インキュベーとされ吸光度が450/690 nmで測定されました。培地を捨てた後、ルシフェラーゼ活性を分析しました。

実験4:
WST-1アッセイはレポータージーン アッセイの結果に干渉しません。CHO-K1細胞が標準的プロトコール(6ウェルプレート、3/6μl FuGENE 6トランスフェクション試薬/2μg DNA)に従い、β-Galプラスミドでトランスフェクトされました。40時間後、WST-1を培養に加えました。コントロールはWST-1とはインキュベートされていません。洗浄後、細胞を溶解しβ-Gal ELISAのプロトコールに従い、レポータータンパク質を定量しました。

製品名	製品番号	包装単位
細胞増殖試薬 WST-1	1644807	2500テスト
ルシフェラーゼ レポータージーンアッセイ、コンスタント ライトシグナル	1897667	1000テスト
FuGENE 6トランスフェクション試薬	1814443	1 ml
β-Gal ELISA	1539426	192テスト