FuGENETM6 トランスフェクション試薬を用いてのTリンパ球のトランジェントなトランスフェクションの成功

2 TIPS and FACTS

Key words: トランスフェクション、ジャーカット細胞、FuGENE^TM6 試薬、lκBの分解

はじめに

< NK-κBは主要な免疫や炎症反応を仲介するダイマーのユビキチン転写因子です。その核内への転座や、特異的12-マーDNA配列との相互作用を妨害する lκBと呼ばれる阻害タンパク質によって細胞質内に閉じ込められます。現在では、細胞がNF-κBのインデューサーであるサイトカインやフォルボールエス テルに露曝されると、lκBのN-末端ドメインがリン酸化され、その後ユビキチン化され分解されることが確立しています。放出されたNF-κBは核に転座 し、転写因子として作用します。

我々はリンパ球が酸化ストレス下に置かれた時のlκBの分解メカニズムを解明しすることに興味を持っています。実験的アプローチとしては、NF-lκBが 仲介する転写に対するミュータントlκBの効果を分析することです。予備実験でジャーカット細胞が、κBCATレポーター構築物と一緒に、野生型あるいは ミュータントlκBを発現するプラスミドでトランスフェクトされ、その後フォルボール12-ミリスチン酸13-酢酸(PMA)とフィトヘムアグルチニン (PHA)で刺激されました。最初にT-リンパ球の効率的で再現性のあるトランスフェクション法が必要でした。FuGENE^TM6 トランスフェクション試薬はこれらのトランスフェクションの実行を満足させる、最初の方法でした。

結果と考察

pκBCATはジャーカットJR T-リンパ球においては低い基底レベルの発現です。4μgのレポーターDNAがプロモーターの基底的な活性を検出するために必要で、9μlのFuGENE^TM6 がこの量のDNAをトランスフェクトするために必要でした。図1はPMA/PHAによるトランスフェクト細胞の刺激が、未刺激のトランスフェクト細胞 (レーン1,2)に比べて強くCAT活性を誘導したことを示しています。低濃度のlκBミュータントベクターとのコトランスフェクションで得られたSer 32-36ミュータントlκBの発現は、このCATの誘導を部分的に停止しました(レーン6,7,8)。しかし野生型(レーン9,10,11)あるいは S283-T-291-T299 lκBミュータント(PESTミュータント)(レーン12,13,14)タンパク質はNF-lκBの転写活性に影響しませんでした。

FuGENE^TM6 トランスフェクション試薬はこれらのトランスフェクションの実行を満足させる、最初の市販品です。それに加えその低毒性は、再現性のあるデータを与える重 要な優位性です。また培地交換や細胞の洗浄、FCSの除去などの時間のかかるステップを必要とする他のテクニック(DEAE-デキストラン、陽イオン性リ ポソームやリン酸カルシウム法)よりも、細胞操作数が少なくなっています。

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図1. NF-lκBが仲介する転写に対するミュータントlκBの効果。

<詳報はこちらへ http://biochem.roche.com/Prod_inf/Biochemi/No1_99/B199scho.htm