FuGENETM6 トランスフェクション試薬を用いてのヒト子宮内膜ガン(HEC-1B)細胞の効率的なトランスフェクション

2 TIPS and FACTS

Key words:トランスフェクション、FuGENE^TM6 トランスフェクション試薬、ガン細胞

はじめに

HeLaやCOSなどの容易にトランスフェクトできる細胞に、特にcAMPなどの機能的パラメータなどに対するドラッグの影響に研究を集中する際に、リコ ンビナントのニューロペプチドY(NPY)レセプターをトランスフェクトすることは、しばしば不可能です。それゆえ、我々の目的はアデニニルサイクラーゼ 活性をパラメーターとして、NPY Y5レセプターのリガンドの機能的アッセイを確立することです。

cAMPの産生はHEC-1B細胞において高い効率で誘導できるので、pCMX-hGFP-PL2ベクターでのトランスフェクション細胞として選択しまし た。我々はリン酸カルシウム沈殿法(文献1)とリポソーマルトランスフェクション試薬であるDOTAPとDOSPER、FuGENE^TM6 トランスフェクション試薬の効率をチェックしました。pCMX-hGFP-PL2ベクターはグリーンフルオレセインタンパク質(GFP)をエンコードしており、その発現は蛍光顕微鏡でのトランスフェクションの評価に用いられます。

結果

リン酸カルシウム法はまったく不完全で、DOSPERでも低率(3%)の転写産物しか得られませんでした。DOTAPとFuGENE^TM6 試薬は高い効率(図1)が得られました。

図1.HEC-1B細胞の形態(パパニコロゥ染色)とそれぞれのトランスフェクション法の発現効率。
pCMX-hGFP-PL2ベクターでの細胞のトランスフェクションによるグリーンフルオレセインタンパク質(GFP)の発現。

　

図2. それぞれのトランスフェクション法のHEC-1B細胞でのGFP発現効率。

FuGENE^TM6試薬では25%、DOTAPでは18%のトランスフェクション効率でした。
FuGENE^TM6試薬はHEC‐1B細胞でもっとも効率的であったため、この試薬をHEC‐1B細胞でのNPY Y5レセプターの発現実験に、選択しました。レセプタータンパク質の合成はトランスフェクト細胞への[³H]-プロピニル-NPYの特異的結合により定量しました。トランスフェクションの2日後、レセプターの発現は3日後より高くなりました(図3)。

図3.トランスフェクション効率におけるインキュベーション時間の効果。
[³H]-プロピニル-NPYの特異的結合は、DNAとFuGENE^TM6 の色々な比での有効性として、pcDNA3-Y5-FLAGのトランスフェクション後48時間と72時間に測定された。スタンダードバー:0.6μl FuGENE^TM6/ウェル; プレインバー: 1.2μl FuGENE^TM6/ウェル。

DNAとFuGENE^TM6 の比は0.33μg/μlFuGENE^TM6で最適の結果が得られました。この至適濃度で2.4μlのFuGENE^TM6試薬を含む20μlのトランスフェクション混合液を各ウェルの細胞に加えました(図4)。

図4.トランスフェクション効率におけるDNAとFuGENE^TM 6 比の効果。
[³H]-プロピニル-NPYのHEC-1B細胞への特異的結合は、DNAとFuGENE^TM6 の色々な比でpcDNA3-Y5-FLAGをトランスフェクションした48時間後に定量した。

詳報はこちらへ http://biochem.roche.com/Prod_inf/Biochemi/No1_99/B199mouse.htm

製品名	製品番号	包装単位
FuGENETM6 トランスフェクション試薬	1815091 1814443	0.4 ml 1 ml