末梢血および骨髄中のBCR-ABLキメラmRNAの検出 －mRNAアイソレーションキット(組織用)とRT-PCRの組み合わせによる慢性ミエリン発生白血病患者よりのサンプル

2 TIPS and FACTS

このセクションは、ロシュ・ダイアグノスティックス製品を用いて、実験系の改良や新規実験などを行った論文を要約したものです。詳細はロシュ・ダイアグノスティックスのインターナショナル版ホームページ、http://biochem.roche.comに掲載のBIOCHEMICA 1999 NUMBER 1をご覧ください。

Keyword：腫瘍細胞の検出、RT-PCR、mRNAアイソレーションキット(組織用)

アブストラクト

ロシュ・ダイアグノスティックスのmRNAアイソレーションキット(組織用)をテストし、慢性ミエリン発生白血病[CML]患者の末梢血および骨髄中より のt[9;22]陽性細胞のRT-PCR検出への有用性を示した。測定の感度を明らかにするため、t[9;22]陽性細胞株のトータルRNAを減らしなが ら、t[9;22]陰性細胞をスパイクした。それに加え異なる患者サンプルをキメラmRNAのために試験した。

はじめに

慢性ミエリン発生白血病患者の95%以上は、ABLプロトオンコジーンが染色体9q34から22q11へ転位し、BCR遺伝子の部分に融合した結果である t[9;22][q34;q11]相互転座で、細胞遺伝学的に特徴づけられます。t[9;22]転座は慢性期の初期に起こり、BCRとABL遺伝子の統合 は白血病過程の発生に関与していると考えられます。

骨髄移植後の永続的なt[9;22]陽性細胞を、細胞遺伝学をベースとして検出することは血疫学的に寛解状態である患者の大部分には不可能です。代りにBCR-ABL遺伝子はその融合転写産物をRT-PCRすることにより効率的に同定できます。キメラmRNA はBCRのM-BCR部位よりのB2あるいはB3エクソンと、ABLよりのA2エクソンを含み、B2A2あるいはB3A2と呼ばれる融合mRNAを形成します。

RT-PCRのために、mRNAはmRNAアイソレーションキット(組織用)で能書通りに分離されました。ライセートはビオチン標識オリゴ[dT]を含む ハイブリダイゼーションバッファーで希釈され、沈殿物は遠心で除去されました。次にストレプトアビジン磁性体粒子が上澄に加えられ、チューブは磁石スタン ドに移されました。分離と再懸濁のステップを繰り返し、ストレプトアビジン磁性体粒子に固相化されたmRNAを洗浄します。最終的に純粋なmRNAが粒子 から11μlの滅菌水で溶出されました。

結果と考察

mRNAアイソレーションキット(組織用)の有用性を保証しアッセイの感度を測定するため、10⁶個の陰性HL-60細胞に、白血病細胞株K-562由来の異なる量のt[9;22]陽性トータルRNAを加えました。mRNA分離のプロトコールとネステッドRT-PCRアッセイの組み合わせは、10⁶個の陰性細胞のバックグランドから約1個の陽性細胞(30 pgのトータルRNA)を検出できました。RNeasy アニオン交換体スピンカラム(Qiagen)を用いた場合は、0.3 ngのトータルRNAを検出できました。mRNAやトータルRNAの品質の高さは、β2-ミクログロブリン mRNAのRT-PCRで評価されました(図1)。

図1. mRNAアイソレーションキット(組織用)を使用し、末梢血や骨髄中の t[9;22]陽性腫瘍細胞のRT-PCRによる検出。
10⁶個のHL-60細胞にK-562由来の異なる量のトータルRNA(3.0 ngから3.0 pg)をスパイクした。トータルRNA及びpoly(A)+ mRNAをそれぞれ分離し、β2-ミクログロブリン(B2M)とＢCR-ABLのRT-PCR増幅を行った。それに加え3人のCML患者のサンプルを RT-PCR分析した(PB:末梢血;BM:骨髄)。患者#1はB2A2融合転写産物に相当するより短い320 bpフラグメントを示した。PCR産物は3%アガロースゲル上で泳動した。VIII：分子量マーカーVIII。

すべてのサンプルで、cDNA増幅のために期待されるRT-PCR断片のみが得られました。それに加え、ゲノムDNAのmRNAサンプルへのコンタミネー ションの可能性は、cDNA合成無しのmRNAの増幅により除外された。陽性結果を示したサンプルはありませんでした。

われわれのRT-PCRアプローチにおいて、トータルRNAにかわりpoly(A⁺) mRNAを使用することで10倍の感度が選られました。またサンプル量が少ない時(10⁴から10⁵個)でも、アイソレーションキットは使用することができました。

詳報はこちらへ http://biochem.roche.com/Prod_inf/Biochemi/No1_99/B199grue.htm

製品名	製品番号	包装単位
mRNAアイソレーションキット(組織用)	1978608	100(25,10) mgサンプルから25(100,250)回分離