保存されていたパラフィン包埋組織中のアポトーシス細胞のTUNEL検出‐落とし穴とその改良

2 TIPS and FACTS

Key Words: TUNEL, archived samples, microwave, pH

TUNEL法は組織切片中のアポトーシスの検出および定量化において、もっとも一般的なテクニックとなっています。すべてのDNA構造の変化に基づく標識方法は、避けることのできないDNAの崩壊のために、その特異性は限られていました。

アポトーシスの核において、2つの大きな障害がTUNEL試薬とその対象との間に存在します。それはDNAの高次の凝縮(pyknosis)と、 DNAを取り囲むタンパク質です。前者はアポトーシスの間に増加し、両者はクロスリンクや沈殿性の固定剤により激化します。この障害に道を開くのが前処理 です。前回までの実験で、均質的に作成されたサンプルに対する至適な前処理法とプロトコールを確立しましたが、今回保存されている不均質な組織での検討を 行いました。これにより外科的に切除され、保存された病理的標本もTUNELによる研究が考慮できるようになりました。ここでの結果より承認できる TUNEL法の問題は次のように要約できます。

1. 前処理無しではTUNELの感度はあまりに低すぎる。
2. 効果が認められる前処理法(例：プロティナーゼKやマイクロウェーブ)は、容易に形態学的に正常な核のラベリングを誘導する。
3. TUNELは固定に大変影響されることが証明された。これは特にサンプルのサイズが重要で、均質で5 mm以下の組織ブロックでなければならない。大きなサンプルでは周辺と中央で固定が同一ではない。これが保存の際のルールである。
4. 組み合わされた時、これら3つのファクターは同一サンプル中に、ブランクのエリアと特異的に染色されたスポットおよびすべての核が染色されるエリアが、存在する原因となる。

図．保存されていたパラフィン包埋切片でのTUNEL法の落とし穴とその改良。
A)無染色：前処理をしない場合、TUNELのDNA断片へのアクセスは無い。倍率x 132。
B)逆の染色：不十分な前処理は高度に折りたたまれたアポトーシスDNA断片にはアクセスさせず(Aと同様)、正常DNA断片に近接させる。倍率x 132。
C)すべての染色：過剰な前処理はDNAを切断し、すべての切断DNAにアクセスさせる。倍率x 132。
D)特異的染色：適切な前処理はより多くのアポトーシスDNA断片を利用する。倍率 x 66。

TUNELはロシュ・ダイアグノスティックスのキットにより、Bouins液固定Graves甲状腺で行われた

結論：アポトーシス細胞と非アポトーシス細胞の間に明瞭な染色の差を得るには？その答えは、TUNEL染色操作法を至適化するための改変ではなく、前処理のステップにある。