ワンステップ、ツーステップRT-PCRに新規 C. therm. ポリメラーゼ登場！

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この新製品はCarboxydothermus hydrogenoformans由来のDNAポリメラーゼのクレノーフラグメントで、60-70℃で至適活性を持ちMg2+依存的に逆転写活性を現します。すべての材料(動物、植物、ヒト、ウイルス、バクテリア)からのRNA(トータルRNA、ポリA⁺ RNA、ウイルスRNA)の極めて特異的で高感度な分析に最適です。

逆転写反応の特異性はプライマーのデザイン、反応温度、ポリメラーゼ、テンプレート量と純度、GC含量に強く依存します。高い反応温度で逆転写を行うことにより、 プライマーの非特異的な結合を減少させ、二次構造の問題も回避できます。

C. therm. ポリメラーゼによるワンステップないしツーステップRT-PCRシステムを用いると、1000コピー以下のウイルスRNA濃度でも、そのRT-PCR産物をアガロースゲル上でのエチジゥムブロマイド染色で可視化できます。C. therm. ポリメラーゼは以下の利点を備えています。

• 60-70℃の高い反応温度により、プライマーのハイブリダイゼーションとその後の伸長反応の特異性を高めます。
• 高い反応温度と、RT-PCRバッファー中のRNAのヘアピン構造の安定性を減少させるDMSOにより、二次構造の問題を最小限にします。
• cDNA合成においてMg2+をコファクターとして用いるため、Tth DNAポリメラーゼよりも2倍以上の信頼性(Fidelity)を持ちます。PCRステップにExpand Hi-Fiなどのプルーフリーディング活性を持つポリメラーゼを用いると、さらに信頼性が高くなります。
• C. therm. ポリメラーゼによる逆転写反応とTaq DNAポリメラーゼによる増幅でdUTPを取り込ませることで、ウラシルDNAグリコシラーゼによりキャリーオーバーコンタミネーションを防ぐことができます。
• 2ステップRT-PCRの逆転写で、4kbまでのcDNAが合成できます(3kb以上の産物のPCRステップにはExpand Hi-Fiの使用をお奨めします)。
• GC-リッチのRNA配列も5-10%のDMSOと1-2%のベタイン存在下で、RT-PCRで増幅できます。
• 非特異的なRNAが大量に含まれていても、逆転写反応は阻害されません。

C. therm. ポリメラーゼ ワンステップ RT-PCR システム

このシステムはC.therm. DNAポリメラーゼとTaq DNAポリメラーゼの混合物で、トータルRNAから高感度で特異的なRT-PCRを、簡便な“ワンステップ”で行えるようデザインされています。

2ステップRT-PCRの逆転写反応用C. therm. ポリメラーゼ

2ステップRT-PCRで最大の柔軟性を得るには、逆転写にこの酵素を使用します。第二ステップのポリメラーゼはTaqやExpand Hi-Fiなど自由に選ぶことができます。

　

アプリケーション

図1. C.therm. DNAポリメラーゼと、Taq DNAポリメラーゼあるいはExpand Hi-Fiを用いての、ウイルステンプレートのRT-PCR増幅。反応条件は温度、DMSO、ベタインについては至適化されている。逆転写は60℃(下記に述べたものを除く)で、30分間行い、ここからの2μlをPCRに用いた。PCR反応は35サイクル行った(伸長 1分/kb)。

図1.

レーン1:人血清由来トータルRNA104コピーよりの、G型肝炎ウイルスRNAの142 bp断片をTaq DNAポリメラーゼでPCR増幅した。
レーン2:K562細胞株由来トータルRNA 200 ngよりのインシュリンライクグロウスファクター IIレセプターRNAの226 bp断片。RT反応は65℃、30分。2 Mベタイン存在下でのExpand Hi-FiによるPCR反応。
レーン3: 104コピーの、G型肝炎ウイルススタンダードの247 bp断片をTaq DNAポリメラーゼでPCR増幅した。
レーン4:マウス肝臓由来トータルRNA 10 ngよりのβ-アクチンRNAの501 bp断片。RT反応は65℃、30分。Taq DNAポリメラーゼによるPCR増幅。
レーン5: 562細胞株由来トータルRNA 250 ngよりのトランスフォーミンググロウスファクター β RNAの650 bp断片。1.5 Mベタイン存在下でのExpand Hi-FiによるPCR反応。
レーン6: マウス肝臓由来トータルRNA 10 ngよりのβ-アクチンRNAの997 bp断片。Taq DNAポリメラーゼによるPCR増幅。
レーン7: マウス肝臓由来トータルRNA 100 ngよりのアデニレートシクラーゼRNAの1.57 kb断片。Taq DNAポリメラーゼによるPCR増幅。
レーン8:ヒト肝臓由来トータルRNA 250 ngよりのアポリポプロテインB RNAの2.45 kb断片。Taq DNAポリメラーゼによるPCR増幅。
レーン9: ヒト肝臓由来トータルRNA 250 ngよりのアポリポプロテインB RNAの3.2 kb断片。Expand Hi-FiによるPCR増幅。
レーン10: ヒト肝臓由来トータルRNA 250 ngよりのアポリポプロテインB RNAの3.8 kb断片。Expand Hi-FiによるPCR増幅。

　

結果: C.therm. DNAポリメラーゼは、Taq DNAポリメラーゼやExpand Hi-Fiとの組み合わせで至適条件(DMSO、ベタイン)下、色々な材料の142 bpから3.8 kb のRNAを逆転写した。

　

　

図2. C.therm. DNAポリメラーゼとExpand Hi-Fi PCRシステム、Oligo dTプライマー(15/20 mer)を用いて 501 bpのβ-アクチン断片の増幅を2ステップRT-PCRで行った。異なる量のマウストータルRNAをテンプレートとして用い、RTステップの温度を変えた。Oligo dTプライマー(15/20 mer)の濃度を0.4μMとし、反応混合液は表示温度で30分間インキュベートした。cDNA反応混合液より2μlを取り、アニーリング温度は60℃、伸長68℃、サイクル当たり1分の条件で、Expand Hi-Fi PCRシステムと遺伝子特異的プライマーで増幅した。

図2.

レーン1-4:oligo dT(20), 50℃ RT, 5μg/1μg/100 ng/10 ng RNA;
レーン5-8:oligo dT(20), 55℃ RT, 5μg/1μg/100 ng/10 ng RNA;
レーン9-12:oligo dT(20), 60℃ RT, 5μg/1μg/100 ng/10 ng RNA;
レーン13-15:oligo dT(15), 50℃/55℃/60℃ RT, 1μg

　

結果: C.therm. DNAポリメラーゼは60℃でも、ツーステップRT-PCRでの逆転写が可能であった。

　

　

図3. C.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステムおよび、AMVリバーストランスクリプターゼとTaq DNAポリメラーゼの酵素ミクスチャーを用いての、HGV-RNAの増幅とdUTPの取込み。反応ミクスチャーは0.2μMのHGV-RNA特異プライマー対、0.2 mMのdATP、dGTP、dCTP、0.6 mMのdUTP、5 mMのDTT、4 UのRNaseインヒビターとC.therm. DNAポリメラーゼあるいはAMVリバーズトランスクリプターゼ(4 U)／Taq DNAポリメラーゼ(2.5 U)を含む。逆転写の反応温度はC.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステムでは60℃、AMVリバーストランスクリプターゼとTaq DNAポリメラーゼの酵素ミクスチャーでは50℃であった。特異的産物の長さは1492 bpである。

図3.

レーン1: AMV/Taq, 10¹⁰コピー数
レーン2: AMV/Taq, 10⁹コピー数
レーン3: AMV/Taq, 10⁸コピー数
レーン4: AMV/Taq, 10⁷コピー数
レーン5: C.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステム, 10¹⁰コピー数
レーン6: C.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステム, 10⁹コピー数
レーン7: C.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステム, 10⁸コピー数
レーン8: C.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステム, 10⁷コピー数

結果：C.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステムは特異的なバンドのみを産生した。

　

　

図4. C.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステムを、マウス肝臓トータルRNAからのβ-アクチン、324 kb断片の増幅とdUTP(PCR Nucleotide MixPlus)の取込みに使用した。さまざまな量のテンプレートRNAをテストした。

図4. C.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステムでのマウス肝臓RNAのβ-アクチン断片の増幅。

　

結果：100 ngから100 pgの特異的産物がアガロースゲル電気泳動とエチジゥムブロマイド染色で検出できた。

　

ツーステップRT-PCR法：

• 高い柔軟性
  －個別にプライミング(1^stステップでOligo dT、2^ndステップで特異的プライマーなど)
  －PCRステップでのDNAポリメラーゼが選択できる
• ベタインの存在、不在下でGC-リッチ配列が増幅できる

ワンステップRT-PCR法：

• コンタミの危険性が少ない
• 簡便
• 迅速

　

製品名	製品番号	包装単位
C.therm. DNAポリメラーゼ ワンステップRT-PCRシステム	2016338 2016346	50回反応 250回反応
C.therm. DNAポリメラーゼ ツーステップRT-PCR用	2016311	300 units
関連製品名	製品番号	包装単位
Taq DNA Polymerase, 5 units/μl	1146165 1146173 1418432 1596594 1435094	100 units 500 units 4 x 250 units 10 x 250 units 20 x 250 units
ExpandTM Hi-Fi PCR System	1732641 1732650 1759078	100 units 500 units 2500 units
Uracil DNA Glycosylase, heat-labile	1775367 1775375	100 units 500 units
PCR Nucleotide MixPlus (dATP, dGTP, dCTP, 200μM, dUTP, 600μM)	1888412	2 x 100μl
dNTPセット、PCRグレード	1969064	25μmol
dATP, PCRグレード	1934511 1969013	25μmol 125μmol
dGTP, PCRグレード	1934538 1969030	25μmol 125μmol
dCTP, PCRグレード	1934520 1969021	25μmol 125μmol
dTTP, PCRグレード	1934546 1969048	25μmol 125μmol
dUTP, PCRグレード	1934554 1969056	25μmol 125μmol
BM Chemiluminescence Blotting Substrate (POD)	1500708 1500694	1 set(1000cm2) 1 set(2000cm2)
BM Chemiluminescence Western Blotting Kit (Mouse/Rabbit)	1520709	1 kit(2000cm2 membrane)
BM Chemiluminescence Western Blotting (Biotin/streptavidin)	1559460	1 kit(1000cm2 membrane)
GST-Western Blotting Kit, chemiluminescence	1779834	1 kit(2000cm2 membrane)
BM Chromogenic Western Blotting Kit (AP, Mouse/Rabbit)	1647644	1 kit(2000cm2 membrane)
Phosphotyrosine Western Blotting Kit (chemiluminescence)	1741756	1 kit(2000cm2 membrane)