FuGENETM 6トランスフェクション試薬の新しいアプリケーション

2 TIPS and FACTS

－ノン・リポソーマルトランスフェクション試薬による真核細胞RNA転写産物のBrUTP標識。

BrUTPの浸透性細胞への露曝や、インジェクションにより初期の、RNAポリメラーゼII転写産物(pre-mRNA)は標識や、その後の免疫検 出が可能です。非浸透性の細胞ではヌクレオチド三リン酸の取込みは大変低いため、リポソーマルトランスフェクション試薬(DOTAP)とBeUTPを混合 し、細胞を標識しました。今回、ノン・リポソーマルトランスフェクション試薬 FuGENE^TM6を用いて、より効率的および簡便にBrUTPの取込みを行いました。

プロトコール

1. 19 mmカバースリップ上でHeLa細胞を50-70 %コンフルエントになるよう培養する。
2. FuGENE^TM 6を20 mM へぺス-サリンで10：1に希釈し、ゆっくり混合した後RTで5分間インキュベートする。
3. この希釈物に0.1容量のBrUTPを加え、BrUTPの終濃度を1-10 mMとする。RTで15分間インキュベートする。
4. 培養プレートよりカバースリップを取り出し、培地を捨てる。パラフィルムのうえに25μlの混合物を滴下し、カバースリップの面を下にしてその上に置く。4℃で15分間インキュベートする。
5. 37℃に暖めたバッファーで軽く洗い、カバースリップをそれぞれのマイクロプレートウェルに戻し、培地と10%の血清で37℃、5-15分間パルスチェイシングする。
6. アイスコールドバッファーで軽く洗い、3.7% フォルムアルデヒドかパラフォルムアルデヒドで、室温20分間固定する。
7. バッファーで2回、300 mM グリシン-サリンで2回洗う。その後0.5% Triton X-100－サリンで、0℃で5分間浸透化する。
8. Anti-ブロモデオキシウリジンと、蛍光標識二次抗体で免疫染色する。

図1.BrUTP/FuGENE^TM