カスパーゼ3 活性アッセイキット－アポトーシス研究に、最高の感度と特異性を！

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ロシュ・ダイアグノスティックスのカスパーゼ3活性アッセイキットは、カスパーゼ3活性を特異的に測定しますので、アポトーシスの初期のイベントで あるカスパーゼ3の活性化を分析できます。アポトーシスは良く知られた一連の形態学的、生化学的変化で特徴づけられます。多くのアポトーシスアッセイ法 は、アポトーシスパスウェイのかなり後期に起こるイベントである核の崩壊、クロマチンの凝集、リーキーな原形質膜の展開などに基づいています。

以前はICE様プロテアーゼといわれていた特異的プロテアーゼのグループである、カスパーゼ(cystein-aspartic acid proteases)の活性化はより早いアポトーシスイベントです。これらカスパーゼは不活型前駆体(プロエンザイム)として合 成され、自己触媒や他のプロテアーゼにより活性化されます。このアポトーシスのもっとも重要なトランスデューサーであるカスパーゼは、特異的な構造、調 節、およびDNA修復タンパク質を分解することにより、細胞の崩壊をイニシエーとします。たとえばカスパーゼが誘導するポリ(ADP-リボース)ポリメ ラーゼの切断は、Anti-PARP抗体によるウエスタンブロットで容易に検出できる、初期のアポトーシスイベントです。

カスパーゼ3(CPP32,YAMA,アポパイン)の活性化は、アポトーシスの過程において主要な役割を持っています。いったんカスパーゼ3が活性化されると元の正常状態に戻る道はなく、細胞死のプログラムは不可逆的に活性化されます。

アポトーシスの間に多くの活性化されたカスパーゼは類似の基質や、同じペプチド基質を切断します。それゆえペプチド基質のみでは、特異的なカスパーゼ活性を測定することは不可能です。

新製品のカスパーゼ3活性アッセイキットは、経口免疫エンザイムイムノアッセイにおいて、カスパーゼ3活性のみを特異的に測定することに成功しまし た。最初にカスパーゼ3特異的モノクローナル抗体がこのプロテアーゼの捕捉に用いられます。この捕捉されたカスパーゼが次に基質を切断し、サンプル中のカ スパーゼ3活性に等しい蛍光分子が収集されます(図1)。

図1. カスパーゼ3活性アッセイキットの測定原理。細胞ライセートのカスパーゼ3が特異的抗体に捕捉される。洗浄操作に続き、基質が加えられる。基質が切断され、遊離の蛍光物質AFCがカスパーゼ活性量に従い生成される。蛍光シグナルを505 nmで測定する。

*Ac-DEVD-AFC = Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-7-amido-4-trifluoromethyl-coumarin

　

このキットの利点

測定原理	マイクロタイタープレート中での蛍光免疫エンザイムイムノアッセイによる、カスパーゼ3活性の特異的、定量的なin vitro 測定(図1)。
アプリケーション	カスパーゼ3活性の完全に特異的な検出と定量 カスパーゼ3インヒビターのスクリーニング
サンプル試料	アポトーシス誘導細胞のライセート リコンビナントのカスパーゼ3
測定時間	約5時間
テスト回数	96テスト(マイクロタイタープレート)
スタンダード	遊離のAFC*(キット内に標準化のために含まれる)
陽性コントロール	250μlのカンプトテシン処理されたアポトーシスU937細胞ライセート(キット内に含まれる)
キット内容	マイクロタイタープレート(12モジュール)を含め、必要な試薬がすべて含まれている

*AFC = 7-amido-4-trifluoromethyl-coumarin

　

　

図2.U937細胞に対するカンプトテシン露曝によるカスパーゼ3活性化のカイネティックス研究。
U937細胞を37℃、異なる時間間隔で、4μg/mlのカンプトテシンに露曝した。ライセートをカスパーゼ3活性と蛍光(ブランクの蛍光を引く)の分析に用いた。同時に同じ細胞サンプルをアネキシンVで分析した。

図3.異なる濃度のカンプトテシン露曝(ドースレスポンスカーブ)によるカスパーゼ3の活性化。
U937細胞を37℃で4時間、異なる濃度のカンプトテシンに露曝した。ライセートをカスパーゼ3活性と蛍光(ブランクの蛍光を引く)の分析に用いた。同時に同じ細胞サンプルをアネキシンVで分析した。

製品名	製品番号	包装単位
カスパーゼ3 活性 アッセイキット	2012952	96テスト