コンペティティブRT-PCRによるヒト サイトカインmRNAの定量 Quantification of Human Cytokine mRNAs by Competitive RT-PCR

2 FEATURES and TECHNICAL TIPS

はじめに

サイトカインは免疫システムにおいて、細胞間及び分子間相互作用の調節に主要な役割を持っています。そのヒト サイトカインmRNAの高感度なコンペティティブRT-PCR定量システムが開発されました。これにより、細胞混合物中と同様に、少ない細胞数や少量の組 織中のmRNAの定量が可能となりました。

特異的RNAの定量は、同量のターゲットRNAを含む一連のサンプルに既知量のコンペティターRNAを加える事で達成されます。RNA分離の前にコンペ ティターRNAを加える事で、分離操作中のRNAの損失を補正する事が出来ます。RT-PCR中に、5’-ビオチン標識リバースプライマーによりビオチン がRT-PCR産物中に取込まれます。RT-PCR後、産物をサイトカイン産物とコンペティター産物の特異的検出のために、ストレプトアビジンコートマイ クロタイタープレートのウェルに分注します。産物はストレプトアビジンに結合する事で捕捉され、その後変性されます。結合した1本鎖RT-PCR産物は 3’-末端にDIG標識された適切な検出オリゴ(サイトカイン検出オリゴおよびコンペティター検出オリゴ)とハイブリダイズされます。その後抗DIG- PODと反応させ、ABTSによる発色で定量します。図1は総合的な手順を示しています。

図1. サイトカインELISAの手順。

　

　

結果と考察

我々は刺激されたヒト末梢血リンパ球中のTNA-αの発現レベルを測定しました。分離された5,000個の細胞サンプルから16,500コピー数のTNF-αmRNAが測定されました(図2)。

図2. 刺激されたヒト末梢血リンパ球中のTNA-αの発現レベルをRT-PCR/ELISAで測定。

定量は通常ELISAで検出されますが、ここではRT-PCRステップの性能を示すためにアガロースゲル分析を加えています。この定量システムの直線性は 図3に表しています。色々なリンパ球数におけるIFNγmRNAの発現レベルを分析した時、200、1,000、5,000個の細胞で、871、 3,597、17,278コピー数のIFNγmRNAを計測し、1個の細胞当たり3.81コピーが産生されていました。３つの測定による標準偏差は 10.4%でした。

　

図3. 刺激されたヒト末梢血リンパ球中のIFNγの発現レベルをコンペティティブRT-PCR ELISAで測定。

このプロトコールでは、異なるコピー数のコンペティターRNAがサンプルに加えられます。これにより、RNA分離中の