直接、間接プライムドIn Situラベリング(PRINS)によるヒト精子核中のX染色体の検出

2 FEATURES and TECHNICAL TIPS

Detection of Chromosome X in Human Sperm Nuclei by Direct- and Indirect-primed In Situ Labeling(PRINS)

はじめに

PRINS法は高感度のPCRとin situハイブリダイゼーションでの蛍光シグナルを組み合わせた、新しい分子細胞遺伝学的技術です。 PRINSは未標識プライマーの相補的配列へのアニーリングと、その後の、標識ヌクレオチド存在下でのDNAポリメラーゼによる伸長が含まれます。新たに 合成されたDNAは蛍光により可視化されます。多くの施設でそれぞれ独自にPRINS法が開発されましたが、全てのサンプルのタイプに等しく応用出来ませ ん。ここではヒト精子核中のX染色体の直接、間接PRINSを行ないました。

材料と方法

直接PRINS法：標識ヌクレオチドにフルオレセイン-12-dUTPを用いる。
間接PRINS法：標識ヌクレオチドにビオチン-12-dUTPを用い、アビジン-FITCで検出。

結果と考察

X染色体のセントロメアに特異的なプライマーを直接、間接PRINSに用いた。蛍光シグナルは確定出来、容易に計測出来ました。図1に標識の例を示します。

図1. 直接(a)および間接PRINS(b)による、ヒト精子核中のX染色体の検出。

直接PRINSでは全ての過程は2時間以内で完了しましたが、間接PRINSでは二次検出過程が加わり、それに3時間かかりました。時間、操作的には直接PRINSが簡便ですが、蛍光強度は間接PRINSより低くなりました。

従来のin situハイブリダイゼーションと比較して、PRINSはヒト染色体中の高コピー数リピートの分布研究に優位性を持ちます。 FISHではオーバーナイトのインキュベーションを必要とするのに対し、PRINSは迅速で、また反応時間が短い事やプライマーに標識がされていない事か ら特異性が高く、バックグランドも低くなります。

また同一サンプル中の一個以上の染色体の同定はフルオレセイン-12-dUTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、AMCA-6-dUTPなどの異なる蛍光色素標識ヌクレオチドを用いたマルチカラーPRINSで行なえます。