アネキシン-V-AlexaTM 568－アポトーシス細胞表面のホスファチジルセリンの検出に

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アポトーシスの第一段階として、細胞表面での原形質膜の転座が観察されます。これらの転座の一つは、フォスファチジルセリン(PS)が原形質膜の内 側から、外側の層や細胞の外部表面へ転移するものです。マクロファージはアポトーシスを起こしているリンパ球表面に露出したPSを特異的に認識します。ア ポトーシス細胞の認識と大食作用は、細胞内成分への曝露より組織を保護し、その結果としてネクローシスに伴った炎症を引き起こします。

Ca²⁺-依存性リン脂質結合タンパク質であるアネキシンVはフォスファチジルセリン(PS)に強い親和性がありますので、細胞膜 の外部表面に露出したPSの高感度のプローブとして使用でき、アポトーシス細胞を検出します。ネクローシス細胞では膜の重合度が失われた結果のPSの露出 によりアネキシンVが結合しますので、この2種類を分別しなければなりません。

その次にBOBO-1などのDNA染色を行うことにより、細胞膜浸透性でないDNAが染色され、アポトーシスとネクローシスが判別できます。モノクローナル抗体による細胞膜成分の染色など他の二次ラベルにより、より深い細胞内成分の研究も可能です。

アネキシン-V-ビオチン、アネキシン-V-FLUOSに加え、新たなAlexa 568標識アネキシン-Vは二重、三重染色応用において更なる柔軟性をもたらします。またアネキシン-V-Alexa 568はきわめて光に安定なのでより強いイメージ像の捕捉が可能です。

図4. 2種類の細胞ポピュレーションの分類とアネキシン-V-Alexa™ 568によるアポトーシスの同時検出。非 アポトーシスRaji細胞をアポトーシスU937細胞あるいは未処理U937細胞と混合し、アネキシン-V-Alexa 568とフルオレセイン標識抗CD4で二重染色を行なった。二重染色細胞のFACS分析：U937を4μg/mlのカンプトテシン不在下(a)、ならびに 存在下(b)で4時間培養し、未処理のRaji細胞と混合した。蛍光：FI.1 = フルオレセイン標識抗CD4、FI.3 = アネキシン-V-Alexa 568。クラスター： F = 生Raji細胞(低アネキシンおよび低CD4結合)、E = 生U937細胞(低アネキシンおよび高抗CD4結合)、G = アポトーシスU937細胞(高アネキシンおよび高抗CD4結合)。アネキシン陽性細胞のCD4標識の減少はアポトーシス細胞上の表面レセプターの脱落によ る。

図5. アポトーシス、非アポトーシス、ネクローシス細胞の分類。アネキシン-V-Alexa™ 568とBOBO™-1で二重染色したU937細胞をFACS分析。4μg/mlのカンプトテシン不在下(a)、ならびに存在下(b)で4時間培養した。 蛍光：FI, 1 = BOBO-1、FI.3 = アネキシン-V-Alexa 568。クラスター：E = 生細胞(低アネキシンおよび低BOBO-1染色)、F = アポトーシス細胞(高アネキシンおよび低BOBO-1染色)、G = ネクローシス細胞(高アネキシンおよび高BOBO-1染色)。

図6. アポトーシス細胞とコントロール細胞のモノクローナル抗体による二重染色。アネキシン-V-Alexa 568とフルオレセイン標識抗CD4で二重染色したU937細胞をFACS分析。4μg/mlのカンプトテシン不在下(a)、ならびに存在下(b)で4時 間培養した。蛍光：FI, 1 = フルオレセイン標識抗CD4、FI.3 = アネキシン-V-Alexa 568。クラスター：E = 生細胞(、F = アポトーシス細胞。アネキシン陽性細胞の減少はアポトーシス細胞上のCD4表面レセプターの脱落による。