TitanTM ワンチューブRT-PCRとキャピラリー電気泳動を用いてのmRNA発現の高精度定量

2 FEATURES and TECHNICAL TIPS

Highly Accurate Quantification of mRNA Expression by Means of Titan^TM One Tube RT-PCR and Capillary Electrophoresis

はじめに

RT-PCRは特に高感度なmRNA分析法で、時には従来のRNAブロット法の1000倍は高感度です。その感度にもかかわらず、定量に関する情報を得るのは困難ですが、それに対処するいくつかのアプローチ法があります。

ハウスキーピング遺伝子を内部コントロールとする半定量的方法は、多くの組織の一つの転写産物を比較するには満足出来ます。この方法はコンペティティブ PCRなどの他の方法に比べ短時間で行なえ、コストも低く済みます。RNAの品質を別にして増幅効率の変動が、標準化においてハウスキーピング遺伝子が必 要な主な理由です。

我々はテンプレートRNAの品質を保証する事により、標準化におけるハウスキーピング遺伝子をもはや必要としない事を示す為にこの研究を行ないました。こ の目的のために高信頼性のTitan™ ワンチューブRT-PCRシステムと、レーザー誘導蛍光検出装置での高感度キャピラリー電気泳動を組み合わせました。

この組み合わせ法の信頼性を検証するために、新鮮なラット組織の転写因子c-fosのmRNA量をPCRサイクルや濃度を変えて測定しました。

結果と結論

Titan^TM ワンチューブRT-PCRはラットの脳と肝臓で、異なるプライマーペアで行ないまた。最初に、それぞれのプライマーペアでサイクル数を増やした場合のキャ リブレーションカーブを引きました(二重測定)。図1aと1bは異なるサイクル数での測定ポイントはほとんど変動がない事を表しています。この事は Titanシステムが高信頼性で、検出システムも正確である事を示してます。

　

図1.c-fosとサイクル数の変化。

1a. PCR当たりのテンプレートは0.5μgトータルRNA、ラット肝臓。蛍光シグナルの直線性は17から28サイクル。
1b. PCR当たりのテンプレートは0.2μgトータルRNA、ラット脳。蛍光シグナルの直線性は26から36サイクル。

上記図の実験より、次のトータルRNA濃度実験には32サイクル目(脳)と26サイクル目(肝臓)を選びました。
図2aと2bは上記で選んだサイクル数で、トータルRNA量を増やした場合の相対蛍光シグナルを表しています。それぞれ高い直線性を示しており、これによりTitanシステムの信頼性が確認されました。

図2. c-fosとトータルRNA濃度の変化。

2a. 26サイクル目でのTitan™ RT-PCR/CE-LIF一重測定。テンプレートは0.5μgトータルRNA、ラット肝臓。
2b. 32サイクル目でのTitan™ RT-PCR/CE-LIF一重測定。テンプレートは0.2μgトータルRNA、ラット脳。

もう一つのファクターは定量に選択した技術です。RT-PCR産物の定量に関しては、アガロースゲルでの分離やシンチレーションカウンティング、ラジオイ メージング、染色ゲルのデンシトメトリーなどの方法がありますが、サンプルのロードや染色時間、強いバックグランド染色などの変動により、不正確な干渉が 見られました。

レーザー誘導蛍光検出を用いたキャピラリー電気泳動はこれらの問題を克服し、Titanシステムの正確な増幅を可視化する際の一番の選択です。Non- RI、オンライン検出での自動操作、100以上のカラムでの泳動、エチジゥムブロマイド/UV検出より高感度などの多くの利点を持ち、簡便にPCR産物の 定量が可能です。ただしこの方法はRT-PCRの指数期の測定のみ有用です。

結論として我々は、TitanシステムとCE-LIF検出の組み合わせは目的のmRNAの定量に高い正確性で使用出来ると確信しています。

製品名	製品番号	包装単位
dNTP Set, Na-salt, PCR Grade	1969064	4x25μmol (250μl)
dATP, Na-salt, PCR Grade	1834511 1969013	25μmol 125μmol
dCTP, Na-salt, PCR Grade	1934520 1969021	25μmol 125μmol
dGTP, Na-salt, PCR Grade	1934538 1969030	25μmol 125μmol
dTTP, Na-salt, PCR Grade	1934546 1969048	25μmol 125μmol
dUTP, Na-salt, PCR Grade	1934554 1969056	25μmol 125μmol
TitanTM One Tube RT-PCR Kit	1939823	50回
TitanTM One Tube RT-PVR system	1888382 1855476	25 units 100 units
TriPureTM Isolation Reagent	1667157 1667165	50 ml 200 ml
RNase Inhibitor	799017 799025	2000 units 10000 units
Thin-walled PCR Tubes	1667041 1667050	1000 tubes (200μl) 1000 tubes (500μl)