FuGENETM 6トランスフェクション試薬を用いての初代心筋培養細胞の、DNAとアンチセンスオリゴヌクレオチドによるトランスフェクション

2 FEATURES and TECHNICAL TIPS

Transfection of Primary Cardiac Myocyte Cultures with DNA and Anti-sense Oligonucleotides Using FuGene™ 6 transfection Reagent

はじめに

ウイルスによる急性心筋炎はヒトにおける重大な疾患ですが、マウスのレオウイルス誘導心筋炎は、ウイルスの誘導する心機能損傷機構を研究する際の優 れたモデルとなっています。レオウイルス感染初代心筋細胞培養での研究において、これらの培養細胞でのインターフェロン-β(IFN-β)のレオウイルス による誘導とIFN-γに対する感受性の両方が、ウイルス性心筋炎の可能性と相関している事が示されました。ウイルスに対する心臓のIFN応答は今まで検 討されておらず、今回これらの細胞でのレオウイルスによるIFN誘導を仲介する細胞因子を同定するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドで初代心筋培養 細胞をトランスフェクトしました。

ここではL社のトランスフェクション試薬D-C、リン酸カルシウム法、ベーリンガー・マンハイムのFuGENE^TM6試薬を比較しました。その結果は以下の通りでした。

1. FuGENE 6トランスフェクション試薬はトランスフェクション試薬D-Cおよびリン酸カルシウム法より多くのβ-ガラクトシダーゼ(β-Gal)発現細胞を産生しました。
2. FuGENE 6試薬は初代心筋培養細胞とL929細胞の両方で、プラスミドの発現するルシフェラーゼ活性を阻害するホスフォロチオエート修飾オリゴヌクレオチドのトランスフェクションを仲介しました。

材料と方法

トランスフェクション法	処理の詳細	培養ウェル当たりのβ-Gal発現細胞数1
FuGENE 6 Transfection Reagent	1.5 μl : 0.0 μg DNA 1.5 μl : 0.25 μg DNA 1.5 μl : 0.75 μg DNA 1.5 μl :1.5 μg DNA 3.0 μl : 0.25 μg DNA 3.0 μl : 0.75 μg DNA 3.0 μl :1.5 μg DNA	0 1000-1400 1200-1600 300-5003 1000-1400 1200-1600 1200-1600
Transfection reagent D-C	10 μl : 0.0 μg DNA 10 μl :1.6 μg DNA2	0 200-400
Calcium phosphate, 4 h transfection	0.0 μg DNA 3.5 μg DNA 7 μg DNA 14 μg DNA 28 μg DNA	0 50-250 50-250 200-400 200-400
Calcium phosphate, 4 h transfection + heat shock	0.0 μg DNA 3.5 μg DNA 7 μg DNA 14 μg DNA 28 μg DNA	0 50-250 50-250 200-400 200-400
Calcium phosphate, 16 h transfection	0 μg DNA 3.5 μg DNA 7 μg DNA 14 μg DNA 28 μg DNA	0 50 - 250 200 - 400 400 - 600 400 - 600

　

表1. 初代心筋培養細胞のトランスフェクション効率。

¹ 2個のウェルでの範囲。0μg DNA出のトランスフェクションは1個のウェル。
² 試薬D-Cの至適比は広範囲な至適化実験で得られた。
³ FuGENE 6試薬の容量(μl)とDNA重量(μg)の比を等量に近づけた時、トランスフェクション効率の減少が観察された。至適なトランスフェクションは試薬量(μl)がDNA重量(μg)を超えた時、観察された。

結果

FuGENE 6は初代心筋培養において、リェージェントD-Cより毒性が低く、またより多くのトランスフェクト細胞を産生した。

初代心筋細胞培養において、トランスフェクション試薬D-C(図1B)やリン酸カルシウム法(図1C)よりFuGENE 6処理後(図1A)の方が、多数の細胞が接着性を保持していました。またpSVβgalのトランスフェクションにおいてもより多くのβ-Gal発現細胞が 産生されました(図1及び表1)。発現細胞の頻度に基づくと、FuGENE 6は1%の細胞をトランスフェクトさせました。トランスフェクション試薬D-Cやリン酸カルシウム法もトランスフェクトの頻度はほぼ同じですが、これらの 方法ではわずかな細胞しか接着性を保持していないため、最終的なトランスフェクト細胞数は非常に少なくなりました。

図1. トランスフェクト初代心筋培養細胞でのβ-Galの発現。初代心筋培養細胞はFuGENE 6(A；15μl FuGENEと0.75μgのDNA)、トランスフェクション試薬D-C(B；10μl試薬Aと1.6μgのDNA)、リン酸カルシウム法(C；14μg のDNAで16時間トランスフェクション)を用いて、pSVβGalでトランスフェクトされた。36-48時間後に基質X-galを加え、その24時間後 に細胞を固定し、写真を撮った(倍率100x)。

FuGENE 6によるアンチセンスオリゴヌクレオチドのトランスフェクションは、レポータータンパク質の発現を阻害した。

FuGENE 6がアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入出来るかどうかを決定するためにL929細胞と初代心筋培養細胞を、ルシフェラーゼ発現プラスミドとル シフェラーゼに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはランダムなシークエンスのオリゴヌクレオチドを混合して、トランスフェクトしました(図 2)。ルシフェラーゼの発現はL929細胞と初代心筋培養細胞ともにアンチセンスによって減少しましたが、ランダムなシークエンスのオリゴヌクレオチドで は減少しませんでした。この事より、FuGENE 6はホスフォロチオエート修飾オリゴヌクレオチドを細胞内に導入出来、二つの異なるDNA(オリゴヌクレオチドとプラスミドDNA)を高頻度で同じ細胞内 にトランスフェクション出来る事がわかりました。

　

図2. FuGENE 6によるトランスフェクションでの、アンチセンスオリゴヌクレオチドによるルシフェラーゼ発現の阻害。3 つのウェルの初代心筋細胞とL929細胞を2μlのFuGENE 6と0.5μgのプラスミドの混合物(pGL3-Control、構築ルシフェラーゼ発現；あるいはpGL3-Basic、ベースラインのルシフェラーゼ 発現；それぞれのプラスミドは他の実験目的のため0.5μgのヘテロガスDNAと混合されている)、および2μgのホスフォロチオエート修飾オリゴヌクレ オチド(C = コントロールのランダムなシークエンスのオリゴヌクレオチド；A = ルシフェラーゼのアンチセンス)でトランスフェクトした。36-48時間のインキュベーションの後、細胞を溶解しルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測 定した。　

FuGENE 6は初代心筋培養細胞や樹立細胞株(L929細胞)において、簡便で効率的なトランスフェクションをもたらしました。その低毒性のため、他の応用に用いる 際にも培地から除去する必要が無く、洗浄操作もありませんので細胞の損失が最少となり、細胞の接着性も最大限保持されます。また血清の存在はトランスフェ クション効率を阻害することがないので、血清を除去する事による悪影響を避ける事が出来ます。最後に3種類の方法を比較して、FuGENE 6は最も簡単な操作法で最も多くのトランスフェクト細胞を産生し、最小限の至適化しか必要としませんでした。

製品名	製品番号	包装単位
FuGENE 6 Transfection Reagent	1815091br> 1814443	4 ml 1 ml