TitanTM ワンチューブRT-PCRシステムを用いての、ウィルムス腫瘍中のイーストヌクレオソームアセンブリータンパク質(NAP1L4)のヒト相同体の分析 Analysis of the Human Homologue of Yeast Nucleosome Assembly Protein (NAP1L4) in Wilms' Tumors, Using the TitanTM One Tube RT-PCR System

2 FEATURES and TECHNICAL TIPS

はじめに

ウィルムス腫瘍(WT)あるいは腎芽細胞腫は小児におけるもっとも一般的な原発性腎腫瘍です。zinc-フィンガータンパク質をコードしている、最初のウィルムス腫瘍遺伝子(WT1)の単離は、WTにおける染色体バンド11p13上の高頻度な変異により見出されました。更なる研究は、WTのわずか15%にWT1での変異が観察されるとしています。この事は散在性WTの11p15.5部位における高頻度な異型接合性の消失(LOH)と共に、第二のウィルムス腫瘍座位が第11染色体の短腕の末端部分に存在するという証拠を提供しています。この遺伝子を同定するために、末端染色体11バンドに隣接する部位のコスミドを集めました。このコスミドはエクソントラッピングアプローチを用いて、高解像度な重積転写及び物理マップを作成するために用いられました。得られたエクソンクローンはシークエンスされ、全長cDNAが分離されました。cDNAの一つは以前に報告されたヌクレオソームアセンブリータンパク質遺伝子(NAP1L4)と高い相同性を示しました。

WTサンプルのNAP1L4遺伝子の変異分析にはRNAを用いましたが、限られた量の組織しか得られなかったため、得られたRNAも少量でノーザンブロットが出来ませんでした。そこでcDNA>の配列より、NAP1L4コード部位のオーバーラップする部分を増幅するプライマーをデザインし、腫瘍からのRNAをRT-PCRした後、それを直接シークエンスしました。

材料と方法

ここでは従来のツーステップRT-PCR法と、ベーリンガー･マンハイムのTitan™ ワンチューブRT-PCRシステムの比較を行なった。

結果と考察

二つのRT-PCR法共にNAP1L4遺伝子の910 bp断片を増幅出来た。両法ともわずか500-1000 pgのRNAより目的の910 bp産物を増幅出来た。

Titan^TM ワンチューブRT-PCRシステムでは910 bpのメインバンドだけでなく、811 bp産物も検出する事が出来た。この低分子バンドのシークエンスより、この産物はNAP1L4 RNAからのエクソン9のスキッピングによると証明された。その他のウィルムス腫瘍ではNAP1L4に変化が無い事より、一般的にこの遺伝子はWTの発育には関与していない事が示唆される。

Titanシステムの高感度はRT反応での特異的プライマーの使用による。その他の利点としては一本の反応チューブと1つのPCRサイクルプログラムにより、簡便でしかも汚染のリスクが最小限に出来る事である。

図2. Titan^TM  ワンチューブRT-PCR後のNAP1L4産物。
レーン1:コントロールRNA(陽性);レーン2: 陰性コントロール(DNAのみ、RNAは無し); レーン3: WTサンプル1; レーン4: WTサンプル2。両方のWTサンプルとも、期待された910 bpフラグメントが見られた。これに加え2ステップRT-PCRでは見えなかった811 bpフラグメントも観察された。

製品名	製品番号	包装単位
TitanTM One Tube RT-PCR System	1888382  1939823 1855476	25回反応  50回反応> 100回反応
ExpandTM High Fidelity PCR system	1732641  1732650 1759078	100 units  500 units 2500 units
Taq DNA polymerase	1146173	500 units
Tth DNA polymerase	1480022	500 units