TitanTM ワンチューブ RT-PCRシステムを用いてのRT-PCR法の至適化 Optimization of the RT-PCR Method Using TitanTM One Tube RT-PCR System

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はじめに

RT-PCRは遺伝子の発現をRNAレベルで測定したり、遺伝子発現の強度、すなわち mRNAの量を少ない材料で定量化する高感度な方法です。それに加え、ミュータントやポルモリフィズムの同定、コストのかかるcDNAライブラリーを作成 しない希少な転写物のクローニングなどの多くの応用例があります。

ここではさまざまなRT-PCR法を、すべての細胞で強く発現しているβ-アクチンと腫瘍 細胞では無いか弱い発現しかしていないB7-1を、分析する事で比較しました。この2種類はそれそれ単独、あるいは同時に増幅されました。T-リンパ腫細 胞株T2と膵臓ガン細胞株Panc1からのトータルRNAをPT-PCR分析に用いました。結果よりより、Titan^TM ワンチューブ RT-PCRシステムは他のRT-PCR反応より数倍感度が増加し、多くの遺伝子の発現分析が同時に再現性良くできる事が示されました。

材料と方法

2ステップRT-PCR(Standard RT-PCR)	1ステップRT-PCR(TitanTM One Tube RT-PCR System)
◆cDNA合成をAMVあるいはMo-MuLVリバーストランスクリプターゼで行う。 ↓(cDNAを別のチューブに移す) ◆Taq DNAポリメラーゼでPCR反応を行う。	◆AMVリバーストランスクリプターゼ、Pwo DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼの酵素混合液により、cDNA合成とPCRを1チューブ内で逐次的に行う。

結果と考察

図1. 2ステップRT-PCRでのT2とPanc 1 RNAよりのPCR産物のアガロースゲル電気泳動。β-アクチンとB7-1プライマーを各々、あるいは組み合わせてRT-PCRを行った。M：100 bp分子量マーカー

2ステップRT-PCRでは、β-アクチンは正しいサイズで増幅されたがB7-1の cDNAの増幅後、シグナルは見られなかった(図1)。またβ-アクチンとB7-1を同時に増幅する事は不可能であった。これらの結果より、従来のRT- PCR法は弱い発現遺伝子の検出には、十分な感度が無い事が示された。1ステップRT-PCRでは、B7-1のPCR産物を検出する事が出来(図2)、 10 ngのトータルRNA量で十分であった(図3)。

図3. B7-1のPCR産物のアガロースゲル電気泳動。TitanワンチューブRT-PCRシステムで、異なる濃度のトータルRNA(1000 ng,100 ng, 10 ng)のRT-PCRを行った。M: 100 bp分子量マーカー

結論として、Titan^TMワンチューブ RT-PCRシステムは、

1. 遺伝子発現の半定量的分析が可能である。
2. 低いRNA濃度しか必要としないため、限られた試料/RNA空のスクリーニング実験に使用出来た。

製品名	製品番号	包装単位
TitanTM One Tube RT-PCR System	1888382 1855476	25回反応 100回反応
Hexanucleotide Mix	1277081	100μl(50回反応)
関連製品	製品番号	包装単位
Taq DNA polymerase, 5 units/μl	1146165 1146173 1418432 1435094 1596594	100 units 500 units 4 x 250 units 20 x 250 units 10 x 250 units
Pwo DNA Polymerase	1644947 1644955	100 units 2x250 units
Reverse Transcriptase AMV	1495062 109118	500 units 1000 units
Reverse Transcriptase M-MuLV	1062603	500 units