TitanTM RT-PCRシステムを用いての、ヒトRPGRのマウス相同体、完全長cDNAの分離

3 Product Review

Isolation of the Full Length cDNA Mouse Homologue Human RPGR Using the Titan^TMRT-PCR System

はじめに

従来、新規cDNAの分離にはcDNAライブラリーのスクリーニングと、陽性クローンの同 定が必要とされていました。この方法は労働集約的で、不完全なcDNAの分離に終わっていました。また一般的に、希少な転写物はcDNAライブラリー内に 十分に発現されないため、数多くのクローンをスクリーニングする必要がありました。RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法は、これら多くの困難を回避しました。PCR産物はトータルあるいはmRNAから作成され、迅速に分析できますので、反応条件の至適化が容易 です。RACE反応用の遺伝子特異的プライマーをデザインするためには、20-30ヌクレオチドの配列情報しか必要としません。RACEシステムでは、本 質的に限られた数のクローンしか作成せず、希少な、スプライスされた転写物を分離できます。

我々はTitan^TMRT-PCRシステムを用いて、RPGRのマウス相同体完全長cDNAを分離しました。ヒ とのRPGRの分離は最近報告され、この遺伝子の変異は網膜変性X-結合型色素性網膜炎を引起こします。RPGRの最初の11エクソンを含む、部分的にス プライスされたcDNAクローンが、マウス網膜のcDNAライブラリーから分離されました。その他のクローンはこのライブラリー内には同定できませんでし たので、Titan^TM RT-PCRシステムはマウス遺伝子の3’-終末の分離に利用できました。

図1. 3’-RACE戦略のスキーム表示。GSP1、GSP2、GSP3は遺伝子特異的プライマーである。プライマーQ_Υ、Q_Ο、Q_{Ιは以下の通り。}

Q_Υ: 5’-CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’ ;

Q_{Ο: 5}’-CCAGTGAGCAGAGTGACG-3’ ; Q_Ι: 5’-GAGGACTCGAGCTCAAGC-3’.

方法

RT-PCR反応は、プロトコール通りに行った。マウス網膜RNA(約1μg)を、独特な35ベースオリゴヌクレオチドの後ろにオリゴ(dT)₁₇を結合した“ハイブリッド”プライマー(Q_Υ)を用いて逆転写した。PCRはExpand^TMHigh Fidelity PCRシステムで行った。RACE産物をサザンブロットで分析した(図2)。

結果と考察

マウス網膜cDNAライブラリーのスクリーニングにより、の最初の11エクソンの後に、クローンが部分的にスプライスされている事を示す終息コドンが含まれた同一配列とダウンストリーム配列のスプライス部位を含む、1.9 kbのクローンが作成された。3’ 終末が欠けたこの遺伝子を含むその他のクローンはライブラリーには同定されなかった。それゆえ3’RACEは完全長の遺伝子の分離に有用であった。

Titan^TMRT-PCRシステムによりcDNAライブラリーをスクリーニングする必要なく、RPGRのマウス相同体の3’終末を迅速に分離できました。また、Expand^TM High Fidelity PCRシステムの使用は、PCR中のエラー率を最小限にし、遺伝子配列の確認のためにシークエンシングする必要性をわずかなものにしました。

製品名	製品番号	包装単位
TitanTMOne Tube RT-PCR System	1888382 1855476	25回反応 100回反応
ExpandTM High Fidelity PCR System	1732641 1732650 1759078	100 units 500 units 2500 units
関連製品	製品番号	包装単位
TitanTMOne Tube RT-PCR Kit	1939823	50反応(コントロール反応10回分を含む)
Taq DNA polymerase, 5 units/μl	1146165 1146173 1418432 1435094 1596594	100 units 500 units 4 x 250 units 20 x 250 units 10 x 250 units
Taq DNA polymerase, 1 unit/μl	1647679 1647687	250 units 4 x 250 units
Pwo DNA Polymerase	1644947 1644955	100 units 2x250 units