TitanTM ワンチューブRT-PCRキット－高感度、迅速、高再現性。

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Titan^TMワンチューブRT-PCRキットは、動物、植物、ヒト、ウイルス、バクテリアよりのRNA(トータルRNA、poly(A) RNA、ウイルスRNA)の分析に有用なツールです。このキットは次の応用が可能です。

－ゲル系あるいはELISA系検出法との組み合わせでの、シングルセルでのRNA転写レベルの定性、半定量、定量分析。

－6 kbまでのRNAのクローニング。

－シークエンス技術や他のミューテーションスキャン法との組み合わせでの、RNAレベルでのミューテーションの分析。

この新しいキットは高い信頼性で高感度、迅速、高再現性なRNA分析するためにデザインされています。このワンチューブ反応システムは第一鎖合成にAMVリバーストランスクリプターゼを使用し、PCR反応にはTaq DNAポリメラーゼの代わりにExpand™ High Fidelityを使用しています。またこのキットには至適化されたRT-PCRバッファー、ヒト細胞株(K562)よりのコントロールRNA、ヒト β-アクチンmRNAのコントロールプライマーが含まれています。

[キット内容]

1. TitanTM酵素ミックス(AMVリバーストランスクリプターゼ、ExpandTMHigh Fidelity)	1バイアル(50μl)
2. dNTPミックス	1バイアル(200μl)
>3. RNaseインヒビター	1バイアル(50μl)
4. ヒトコントロールRNA(K562トータルRNA)	1バイアル(50μl)
5. コントロールプライマーミックス(ヒトβ-アクチン)	1バイアル(20μl)
6. 再蒸留水(PCRグレード)	1バイアル(1 ml)
7. RT-PCR反応バッファー	1バイアル(1 ml)
8. DTT溶液	1バイアル(1 ml)
9. MgCl2ストック溶液	1バイアル(1 ml)

TitanワンチューブRT-PCRキットは次の利点を持っています。

• 高い温度でのAMVの使用と、RT-PCRバッファー中のDMSOによるRT反応の改善により、RNAのヘアピン構造の安定性を低下させ、RNAの二次構造に由来する問題が最小限となります。
• Pwoのプルーフリーディング活性により、PCRでのエラー率が減少します。Taq DNAポリメラーゼに比べ3倍の正確性が得られます。これは、RT-PCRの逆転写の間の正確性も増加させる為かどうかはわかっていません。
• Expandシステムにより、6 kbまでのフラグメントの増幅が可能です。
• 三種類の酵素の高い効率により、感度が増加しています。
• 従来の2ステップRT-PCRより迅速です。
• ヒトコントロールRNAとヒトβ-アクチンRNAに対するコントロールプライマーが添付されます。
• RT-PCRに必要なすべての試薬(dNTPミックス、RNAインヒビターなど)が含まれています。

製品名	製品番号	包装単位
TitanTM One Tube RT-PCR Kit	1939823	50反応(コントロール反応10回分を含む)
TitanTMOne Tube RT-PCR System	1888382 1855476	25回 100回
関連製品	製品番号	包装単位
Taq DNA polymerase, 5 units/μl	1146165 1146173 1418432 1435094 1596594	100 units 500 units 4 x 250 units 20 x 250 units 10 x 250 units
Pwo DNA Polymerase	1644947 1644955	100 units 2x250 units
Tth DNA Polymerase	1480014 1480022	100 units 500 units
ExpandTM Long Template PCR System	1681834 1681842 1759060	100 units> 500 units 2500 units
ExpandTM High Fidelity PCR System	1732641 1732650 1759078	100 units 500 units 2500 units
cDNA Synthesis Kit	1117831 1013882	25μg RNAの転写 50μg RNAの転写

図1. cDNA合成の温度を変える事による、RT-PCRの感度への効果。Titan^TMワンチューブRT-PCRシステムと324 bpのマウス β-アクチンテンプレートを用いて行った。異なる量のトータルマウス肝RNAをテンプレートとして用いた。

cDNAの合成は45℃(パネルA)、50℃(パネルB)、55℃(パネルC)、60℃(パネルD)で30分間行われ、その後PCRを行った(35サイクル)。PCR産物の一部(15μl)を1 %アガロースゲルで分析した。

レーン1：10 ngトータルマウス肝RNA；レーン2：5 ngトータルマウス肝RNA；レーン3：1 ngトータルマウス肝RNA；レーン4：500 pgトータルマウス肝RNA；レーン5：100 pgトータルマウス肝RNA；レーン6：50 pgトータルマウス肝RNA；レーン7：10 pgトータルマウス肝RNA；レーン8：1テンプレートを含まない陰性コントロール；レーン9：DNA分子量マーカー VI

図2. Titan^TMワンチューブRT-PCRキットの原理

図3. cDNA合成温度のRT-PCRの感度への効果。Titan^TMワンチューブRT-PCRシステムと1.9 kbpのジストロフィンテンプレートを用いた。異なる量の骨格筋細胞RNAをテンプレートとして用いた。条件は図1と同じ。レーン1-8中のRNA量も同じ。レーン9：DNA分子量マーカー III。

図4. Titan^TMワンチューブRT-PCRシステムでのいろいろなRT-PCR産物の増幅。能書に従い、RT-PCRを行った50℃でのRNA合成および35 PCRサイクル)。PCR産物の一部(15μl)を1.2 %アガロースゲルで分析した。レーン1,14：DNA分子量マーカー VII；レーン2,13：DNA分子量マーカー VI；レーン3：980 bp G3PHD/10 ng トータルヒト肝RNA；レーン4：324 bpβ-アクチン/1 ngトータルマウス肝RNA；レーン5：530 bp MCAD/10 ng トータルヒト肝RNA；レーン6,7：1.9 kbpと4 kbpのジストロフィン/10 ng トータルヒト骨格筋細胞RNA；レーン8,9：1 kbと419 bpのPSMA/100 ng LNCap細胞株のトータルRNA；レーン10：145 bp HCV/約5000コピー；レーン11：291 bpインターロイキンI-β/200 ngトータルヒト血液RNA；レーン12：192 bp M-CSF/100 ng トータルヒト肝RNA.