RT-PCRとmRNAアイソレーションキット (血液／骨髄用)の組み合わせによる、末梢血での腫瘍関連抗原遺伝子発現の検出 Detection of Tumor-associated Antigen Gene Expression in Peripheral Blood by RT-PCR in Combination with the mRNA Isolation Kit for Blood/Bone Marrow

2 FEATURES and TECHNICAL TIPS

Key words：

悪性メラノーマ、RT-PCR、poly(A) mRNA精製、mRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)

Abstract：

ベーリンガー･マンハイムのDNA/RNA安定化試薬(血液／骨髄用)とmRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)を応用してのpoly(A) mRNA精製操作が、末梢血よりの播種性腫瘍細胞の検出に応用できるかを、高感度RT-PCRとpoly(A) mRNA分画との組み合わせによる使用で、検討した。高感度な技術を確立するため、樹立腫瘍細胞株より一定の数のメラノーマ細胞を取り、健常者の末梢血サンプルに加えた。

はじめに

皮膚における悪性メラノーマは、多くのヨーロッパ諸国で1年間に3-7%の範囲で増加して います。腫瘍関連抗原(TAA)への臨床的に意義のある免疫応答が起こる可能性は長い間疑問視されていましたが、MAGE-1やMAGE-3などの多くの メラノーマTAAがクローニングされたことにより、いくつかのHLA-1クラス1がTAAエピトープを制限し、細胞障害性T-リンパ球(CTL)に、標的 として提示している事が確認されました。MAGEファミリーのTAAはその正しい特異性のため多くの興味を持たれていますが、メラノーマ細胞全体の 30-60%にしか発現されません。その他のMART-1/Melan-A、gp 100、チロシナーゼなどのTAAは、腫瘍細胞や非形質転換メラノサイトなどで発現されています。ほとんどすべてのメラノーマでこれらの遺伝子が発現され ています。

抗原を標的とする免疫治療における患者の選択は、腫瘍細胞から分離したmRNAをRT-PCRで評価する、抗原発現の分析に基づきます。

我々は、ベーリンガー･マンハイムのDNA/RNA 安定化試薬(血液／骨髄用)とmRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)を応用してのpoly(A) mRNA精製操作が、末梢血よりの播種性腫瘍細胞の検出に応用できるかを、高感度RT-PCRとpoly(A) mRNA分画との組み合わせによる使用で、検討しました。高感度な技術を確立するため、樹立腫瘍細胞株より一定の数のメラノーマ細胞を取り、健常者の末梢血サンプルに加えました。

材料と方法

半定量的なRT-PCRの結果を得るため、1 mlの健常者末梢血に、1 x 10⁴、1 x 10³、1 x 10²、1 x 10¹、1個のメラノーマ細胞(HBL細胞株)を加えた。ベーリンガー･マンハイムのDNA/RNA 安定化試薬(血液／骨髄用)とmRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)を用いてpoly(A)-mRNAを分離した。1 mlの血液から精製されたすべてのmRNAは標準法により直接、cDNAに変換された。次に、それぞれのサンプルに含まれるすべてのcDNA(約2 x 10⁶末梢血単核球(PBMCs)プラス1 x 10⁴、1 x 10³、1 x 10²、1 x 10¹、1個のメラノーマ細胞のテンプレートに相当)が、1回のPCR反応(60サイクル)に用いられた(図1)。

図1. 1 x 10⁴、1 x 10³、1 x 10²、1 x 10¹、1個のメラノーマ細胞を加えられた1 mlの末梢血(約2 x 10⁶ PBMCs)よりの、三種のTAA(MART-1/Melan-A、gp 100、チロシナーゼ)のRT-PCR増幅産物。

結果と考察]

我々の用いた精製法とRT-PCR法の組み合わせは、次の発現量の検出に十分な感度であった。

mRNA調製物中の残余のクロモソームDNAの増幅の可能性は、cDNAを作成する前の調製物をPCRす る事で確認され、陽性が出ない事で否定された。高濃度のトータルRNAやクロモソームDNAなどの阻害因子が不含のため、反応の特異性と感度が増加した。 この2種類のキットを用いる精製法は、末梢血サンプルの取り扱いが簡単な為、操作の信頼性が高まった。Ficoll^(R) 勾配遠心を必要としないため、腫瘍細胞を失う危険性がなくなった。もう一つの利点としては、DNA/RNA 安定化試薬(血液／骨髄用)を加えた後、末梢血溶解物を-20℃で凍結保存できるため、核酸の分解が防げる事である。