生物医学研究に最高の簡便さと感度を!

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今回、ベーリンガー･マンハイムでは核酸の分析に基づく、新世代の生物医学研究用試薬の上市をアナウンスします。 これらの製品は、疾病過程の基礎的研究開発における血液や骨髄サンプルの調製やハンドリングをより効率よく、簡便にするためにデザインされています。下記 に述べる製品はそのシリーズの最初の3品目です。

DNA/RNA 安定化試薬(血液／骨髄用)

10容量の安定化試薬を1容量の血液や骨髄液に、単純に加えるだけで、すべての核酸は即時 に安定化されます。この簡単な処理の後、核酸は-20℃で長期保存可能で、4℃では1日保存できます。試薬の成分(グアニジンチオシアネート、界面活性 剤、還元剤)は直ちにすべての細胞を溶解し、保存や取り扱いの間に核酸を分解する恐れのあるヌクレアーゼを不活化します。サンプルの採取に用いられる標準 的な抗凝固剤(ヘパリン、EDTA、クエン酸)は安定過程に影響しません。安定化されたサンプルよりのmRNAやその他の核酸の分離は、次の述べられる mRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)で、簡便に行えます。

このDNA/RNA 安定化試薬(血液／骨髄用)は次の利点をもたらします。

• 血液サンプルや骨髄液中のRNAやDNAを分析のために研究室へ輸送する前に、採取と同時に迅速に安定化します。
• 採取と同時にヌクレアーゼを不活化するために、核酸の定量化での精密性が増加します。
• 試薬量の計算における間違いが避けられます。単に10容量の試薬を1容量のサンプルに加えるだけです。

図8. 骨髄は腫瘍細胞の検出に適している。3 mlのヘパリン処理骨髄をDNA/RNA 安定化試薬(血液／骨髄用)で溶解した。100 pg、10 pg、0 pgのメラノーマ細胞株(MelJu) mRNAを1 mlの血液に相当するそれぞれの溶解液に加えた。mRNAは各溶解液より、mRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)で分離した。溶出液をチロシ ナーゼcDNA特異的プライマー(HTYR1、HTYR2)を用いてRT－PCRを行った。PCR産物をPCR ELISAで検出した。

mRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)

DNA/RNA安定化試薬(血液／骨髄用)で安定化した後、血液／骨髄からのmRNAやDNAの分離にはこの革新的なキットを使用してください。

キット内容

1. 磁性体ガラス粒子(MGP)	5ボトル(5 x 50錠)
2. MGP洗浄バッファー	2ボトル(2 x 20 ml)
3. MGP溶出バッファー	1ボトル(33 ml)
4. ハイブリダイゼーションバッファー	1ボトル(17 ml)
5. ビオチン標識オリゴ(dT)20プローブ	1ボトル(330μl)
6. ストレプトアビジンコート済み磁性体粒子(SMP)	1ボトル(3.3 ml)
7. SMP洗浄バッファー	1ボトル(110 ml)
8. 再蒸留水	1ボトル(18 ml)

この分離技術の基礎にあるものは、特殊な磁性体ガラス(MGP)です。このMGP(錠剤)を直接、安定化 血液／骨髄サンプルに加えます。カオトロピック塩であるグアニジンチオシアネートの存在下、30分間のインキュベーションの間に、核酸が粒子のガラス表面 に結合します。短い遠心(2分間)で、MGPは沈殿します。ビーズを2 mlのプラスチックチューブに移した後、マグネチックセパレータ(別売)により、簡便に洗浄します。低塩濃度バッファーは、直接PCRに用いられるよう MGPより核酸を溶出させます。またその他に、非分解の高純度mRNAをトータル核酸から分離するには、ビオチン標識オリゴ(dT)20プローブによるハ イブリダイゼーションとストレプトアビジンコート済み磁性体粒子及びマグネチックセパレーターを用います。

図9. 5 ml、3 ml、1.5 mlの正常ヒトヘパリン処理血液をDNA/RNA 安定化試薬(血液／骨髄用)で溶解した。mRNAは各溶解液より、mRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)で分離した。各溶出液の30%をDIG標識アンチセンスRNA、β-アクチンプローブによるノーザンブロットで分析した。A: 5 ml血液; B: 3 ml血液; C: 1.5 ml血液.

図10. ヒトヘパリン処理血液と骨髄をDNA/RNA 安定化試薬(血液／骨髄用)で溶解した。mRNAは各溶解液より、mRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)で分離した。0.8 mlの骨髄あるいは1 mlの血液に相当するmRNAをDIG標識アンチセンスRNA、β-アクチンプローブによるノーザンブロットで分析した。A; 骨髄; B: 骨髄.

mRNAアイソレーションキット(白血球細胞(WBC)用)

このキットは新鮮血のWBC分画からのmRNAやDNAの迅速回収を可能とします。初期操 作は赤血球の溶解とWBCペレットを得るための遠心という簡単なものです。次の操作での溶解/結合バッファーの添加により、WBCは溶解されRNaseも 不活化されます。操作のこの時点より、mRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)とまったく同じ操作となります。簡略にいうと、MGPへのトータル 核酸の結合、溶出とoligo(dT)20プローブでのハイブリダイズ、ストレプトアビジンコート済み磁性体粒子による分離です。分離したmRNAの全量 が、大変少ない量(20 μl)の溶出バッファーで溶出できます。 このキットは3 mlの全血からのmRNA、5 pgが検出できるよう、機能試験がされています。このキットは血液サンプルの希少なメッセンジャーの効率的な分離に用いられます。

キット内容

1. 赤血球溶解バッファー	3ボトル(3 x 110 ml)
2. WBC溶解バッファー	1ボトル(50 ml)
3. 磁性体ガラス粒子(MGP)	2ボトル(2 x 50錠)
4. MGP洗浄バッファー	2ボトル(2 x 20 ml)
5. MGP溶出バッファー	1ボトル(33 ml)
6. ハイブリダイゼーションバッファー	1ボトル(17 ml)
7. ビオチン標識オリゴ(dT)20プローブ	1ボトル(330μl)
8. ストレプトアビジンコート済み磁性体粒子(SMP)	1ボトル(3.3 ml)
9. SMP洗浄バッファー	1ボトル(110 ml)
10. 再蒸留水	1ボトル(1.1 ml)

血液／骨髄用および白血球用mRNAアイソレーションキットにより次の事が可能となります。

• 1 - 5 mlの血液や骨髄サンプルの調製が簡単に出来ます。
• RT-PCRに使用出来る高品質な非分解mRNAが分離できます。
• PCRやRT-PCRにより、大容量の血液や骨髄液に希釈されている希少なmRNAを検出できます(最少残余疾病細胞、播種性腫瘍細胞の検出などの応用の可能性)。
• ノーザンブロット、ヌクレアーゼプロテクションアッセイ、プライマー伸長研究、cDNA合成などの、すべてのダウンストリーム応用のためのmRNAが分離できます。
• 5 mlの血液中のmRNAをわずか20μlのRNaseフリー溶液中にまで、濃縮、溶出できます。
• 5 mlの血液サンプルより分離された全mRNAを1回のRT-PCR反応に使用する事が出来ます。
• 一般的な血液サンプル1 mlから50-200 ngと、高収量なmRNAが得られます。
• 再現性も良好で、収量の変動は10 %以内です。
• 希少な目的細胞を失うような細胞分離操作がありません。

図11. mRNAアイソレーションキット(白血球細胞(WBC)用)での典型的結果。30 mlのヘパリン処理、正常ヒト血液を各5 mlずつ6本に分けた。それぞれの血液からmRNAを分離した。収量はA_{260 nm}(1 A_{260 nm}ユニットは40μg mRNA/mlに相当)で測定後、計算した。

A: 6サンプル液から得られたmRNAの収量;平均mRNA量は630 ng/5 ml、SDは6.9 %、A_{260 nm}/_{290 nm}の比はすべてのサンプルで1.9以下であった。

B: 6サンプル液よりのmRNAをDIG標識アンチセンスRNA、β-アクチンプローブを用いてノーザンブロットで分析した。

C: 6サンプル液の分光光度計によるスキャン。

製品名	製品番号	包装単位
DNA/RNA 安定化試薬(血液／骨髄用)	1934317	50 mlサンプル用
mRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)	1934333	1.5 ml(3 ml, 5 ml)サンプルからの100(50, 30)回分離
mRNAアイソレーションキット(白血球細胞(WBC)用)	1934325	1.5 ml(3 ml, 5 ml)サンプルからの100(50, 30)回分離
関連製品	製品番号	包装単位
mRNA Capture Kit	1787896	192回反応
mRNA Isolation Kit	1741985	70 mg poly(A+)RNAの分離
DNA Isolation Kit(哺乳細胞用)	1667327	1キット
Northern ELISA	1758403	96回反応
Red Blood Cell Lysis Buffer	1814389	100 ml
Magnetic Particle Separator	1641794	4チューブ用
Streptavidin-coated PCR Tubes	1741772	8 x 0.2 mlチューブおよびキャップ24ストリップ
Titan™ One Tube RT-PCR System	1888382 1855476	25回反応 100回反応

上記新製品についての詳細は、下記の記事“RT-PCRとmRNAアイソレーションキット(血液／骨髄用)の組み合わせによる、末梢血での腫瘍関連抗原遺伝子発現の検出”をご参照下さい。