PCRクローニングキット(ブルントエンド) －陽性トランスフォーメントの選択を高クローニング効率(末端の前処理はいりません)で！

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多くの分子生物学的実験で、平滑末端の断片をプラスミドに組み込み細胞内にトランスフォームし、コロニーの分離のために選択培地に播種する事が一般的に行われています。PCR断片などの平滑末端断片は、高いクローニング効率を達成する平滑末端ライゲーションに直接用いる事が出来ます。ベーリンガー･マンハイムのラピッドDNAライゲーションシステムの技術を利用したこのPCRクローニングキットで、小さなPCR DNA断片(< 1.5 kb)と同様10 kbまでのより大きなDNA断片も、迅速、簡便に高効率でクローニングする事が出来ます。

キット内容

1. pCAPSクローニングベクター	1バイアル(10 μl)
2. 制限酵素Mlu NI、1 U/μl	1バイアル(20 μ)
3. SuRETM/Cut Buffer A	1バイアル(1 ml)
4. PCRコントロールテンプレート(500 bp)	1バイアル(20 μl)
5. T4 DNAリガーゼバッファー	1バイアル(0.5 ml)
6. T4 DNAリガーゼ希釈バッファー	1バイアル(0.5 ml)
7. T4 DNAリガーゼ、5 U/μl	1バイアル(40 μl)
8. プライマー1、47-mer	1バイアル(240 μl)
9. プライマー2、47-mer	1バイアル(240 μl)

新しいキットを開発するために用いられた技術は、異化代謝産物アクチベータータンパク質(CAP)の致死ミュータント遺伝子を含む、特別にデザインされた自殺ベクター(pCAP^S; 3.1 kb)に基づいています。PCRや他の方法で作成された平滑末端断片のMlu N1サイトへのライゲーションにより、CAP遺伝子の発現が分断されます。トランスフォーメーション後、陽性組換え体のみが育成され、非組換え致死遺伝子を持つ細胞はトランスフォーメーション過程の間に死滅します。

図5. pCAP^Sのマルチプルクローニングサイト

T7とSP6ポリメラーゼのプロモーター部分を含むPCRプライマーにより、陽性クローンのスクリーニングは直接PCRと、その後のin vitroトランスクリプションの為のクローン化断片の増幅で可能となります。

クローンされるDNAは、耐熱性のプルーフリーディングDNAポリメラーゼで作成した平滑末端PCR DNA断片や、その他の平滑末端DNA断片であるべきです。Pwo DNAポリメラーゼやExpand^TM High Fidelity PCRシステムの使用が薦められます。断片は末端のいかなる処理(精製や削除)も必要とせず、直接使用でき、クローニング効率は90 %以上です。

Expand^TM High Fidelity PCRシステムはまた、DNA断片の末端処理にも使用できます。

このキットは35回クローニング反応と5回コントロール反応用ですが、プライマー1とプライマー2は更なる分析(480 PCR反応に十分)にも使用できます。

キットの利点

• 制限酵素Mlu N1と至適バッファーが含まれますので、ベクターの迅速で正確な平滑末端を持つ直鎖化ができます。直鎖化のステップはトランスフォーメーション過程での擬陽性クローンの発生を防ぎます。
• キットにはT7とSP6ポリメラーゼをプロモートする2種類のプライマーが含まれおり、クローンへのインサートの同定に使用出来ます。またT7とSP6のプロモーター部位はその他、in vitroトランスクリプション、PCR分析、マッピングなどにも使用できます。
• 本キットはExpand^TMHigh Fidelity PCRシステムとの組み合わせで用いる事も出来ます。この製品はdAオーバーハングと平滑末端のPCR DNA断片の混合物を作成します。
• 広範囲の細胞がトランスフォーメーションに使用出来ます(JM 103、HB 101、XL-1ブルーなど)。

製品名	製品番号	包装単位
PCR Cloning Kit(blunt end)>	1939645	35回クローニング反応＋5回コントロール
関連製品	製品番号	包装単位
Ampicillin	835242 835269	5 g 50 g
SP6/T7 Transcription Kit	999644	2 x 20反応
DIG RNA Labeling Kit(SP6/T7)	1175025	2 x 10標識反応
PCR Core Kit>	1578553	100PCR反応
Taq DNA polymerase, 5 units/μl	1146165	100 units
PCR Buffer set	1699121	各々1 ml
dNTP Set(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)	1277049 1922505	4x10μmol 40x10μmol
T4 DNA Polymerase	1004786 1004794	100 units 500 units
Pwo DNA Polymerase	1644947 1644955	100 units 2x250 units
High Pure PCR Product Purification Kit	1732668 1732676	50回精製 250回精製
High Pure Plasmid Isolation Kit	1754777 1754785	50回精製 250回精製
Agarose Gel DNA Extraction Kit	1696505	最大100回
Expand High Fidelity PCR System	1732641 1732650 1759078	100 units 500 units 2500 units