テロメラーゼPCR ELISAによる、電離照射処理後のHeLa細胞中のテロメラーゼ活性の測定 Determination of Telomerase Activity in HeLa Cell After Treatment with Ionizing Radiation by Telomerase PCR ELISA

2 FEATURES and TECHNICAL TIPS

Key words：

テロメラーゼ活性、ATM遺伝子、電離照射

Abstract：

テロメラーゼ活性はしばしば悪性腫瘍の表現型と関連する。放射線療法は、多くの腫瘍の治療において主要な役割を示す。電離照射後、どの分画 の腫瘍細胞が生存できるかを測定する事は困難である。我々は、電離照射が誘導した細胞死と、テロメラーゼ活性の間に相関性があるかどうかの測定を試みた。 テロメラーゼ活性は、テロメラーゼPCR ELISAキットを用いて、電離照射処理後のHeLa細胞中の活性が測定された。テロメラーゼPCR ELISAは、アッセイ当たり0.02μgのタンパク量でのテロメラーゼ活性を測定するのに十分な感度であった。テロメラーゼ活性の直線的な増加は、 0-1.2μgの蛋白濃度間で見られた。我々の実験結果は、テロメラーゼ活性の減少と電離照射により誘導される再現された細胞死とは、パラレルである事を 示した。

［はじめに］

ヒト染色体の末端には数kbのテロメアリピート(TTAGGG)_nが 存在しますが、DNAポリメラーゼは直線状のテンプレートの終末を複製できないため、体細胞では複製のたびにテロメアは短くなっていきます。生殖細胞など の不死細胞では、テロメラーゼが染色体末端にテロメアリピートを付加する事により、この現象が相殺されます。またテロメラーゼはほとんどすべてのガン細胞 に存在し、そのテロメラーゼ活性レベルは発ガンのステージと相関していますので、その活性測定は多くの悪性腫瘍の臨床的診断に大きな可能性を持っていま す。この事より、高感度で信頼性があり、しかも迅速なテロメラーゼ活性測定法が必要とされます。

テロメラーゼ活性はHeLa細胞のクルードな抽出物中で、1989年に生物化学的方法によ り初めて測定されました。1994年にはPCRに基づいたTRAP法が開発され、感度が高まりました。TRAP法は伸展し、Non-RIのELISA法に 基づくアッセイ法がベーリンガー･マンハイム社により開発されました。我々はテロメラーゼPCR ELISAを用いて、電離照射処理後のHeLa細胞中のテロメラーゼ活性を測定しました。

[材料と方法]

照射：血清を抜いた、コンフルエントなHeLa細胞に0から40 Gyのγ線を、1.1 Gy/minの率で照射した。照射後の細胞を色々な時間毎に採集した。、細胞数がカウントされ、テロメラーゼアッセイとコロニー形成のために分注された。

クローン形成アッセイ：照射後の細胞の生存はクローン形成アッセイで測定された。細胞を分散し、一個の細胞後とに播種した。培養10日後に、50細胞以上のコロニーをコロニー形成能を持つ生存細胞から派生したと評価した。

テロメラーゼアッセイ：100万個の細胞を1回のテロメラーゼアッセイに用いた。溶解後、上澄の蛋白濃度を測定し、さまざまな蛋白濃度の細胞抽出物をテロメラーゼアッセイに用いた。

(プロトコール)

1. テロメアリピートは、テロメラーゼによりビオチン標識プライマーが付加される。
2. PCRによる増幅。
3. PCR産物をストレプトアビジンコート済み96穴プレートに固相化。
4. DIG標識テロメアリピート特異的プローブとハイブリダイズ。
5. POD標識Anti-DIGとTMBで発色させ、プレートリーダーで測定。

[結果と考察]

細胞の生存率とガンマ線照射量の相関関係は、クローン形成アッセイで測定された(図1)。

テロメラーゼPCR ELISA法の確立と、アッセイ感度をコントロールするために、さまざまな蛋白濃度でテロメラーゼ活性を測定した。0-1.2μgの蛋白濃度で、テロメ ラーゼ活性は直線的に増加した(図2)。この事より、1μgの蛋白濃度でテロメラーゼ活性を測定する事とした。細胞当たりのタンパク量の減少が電離照射後 観察され、その減少量は照射量および時間と相関していた。

細胞の生存率とテロメラーゼ活性の相関関係は、照射処理後0-148時間のさまざまな時点 毎にテロメラーゼ活性を測定する事で検討した(図3)。照射直後のテロメラーゼ活性は、照射量に関わらず差違が無かった。処理後24時間と48時間のテロ メラーゼ活性がもっとも顕著な差違を示した。しかしテロメラーゼ活性の減少は、96、124、148時間後に顕著であった。

図3. 各γ線照射量処理後の、各時点のHeLa細胞中のテロメラーゼ活性の定量。照射後96時間の時点において、テロメラーゼ活性の減少と照射量が相関する事に注意。テロメラーゼアッセイは、1μgの蛋白濃度で行われた。

以上の結果は、新生(腫瘍)細胞の生存がテロメラーゼ活性を追う事でモニター出来る事を示唆しています。テロメラーゼ PCR ELISA法は、限られた数の細胞でアッセイを行えます。テロメラーゼ活性測定は、腫瘍細胞の放射線療法の成果を判定するための有用なマーカーであると考えられます。

製品名	製品番号	包装単位
Telomerase PCR ELISA	1854666	96テスト
関連製品	製品番号	包装単位
PRINS Oligonucleotide Primer, human telomere specific	1699199	100μl(20反応)
DIG PRINS Reaction Set	1695932	45反応
Rhodamine PRINS Reaction Set	1768514	45反応